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基于CRISPR系統(tǒng)開發(fā)出的引導編輯系統(tǒng)（Prime Editing, PE）能夠在基因組的靶位點處實現精準的片段插入、刪除及堿基的任意替換，在基因治療、育種改良、基礎研究等方面展現出了巨大的應用前景。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組前期在水稻、小麥中建立并優(yōu)化了植物引導編輯系統(tǒng)，實現了任意堿基精準的替換、增添或刪除。然而在應用過程中，研究組也發(fā)現該系統(tǒng)依然存在效率偏低、設計復雜等問題，難以滿足育種需要及在不同基礎研究場景下的需求（Lin et al., Nature Biotechnology, 2020）。對此，研究組通過對PE系統(tǒng)進行多輪升級改造，成功開發(fā)了“Tm值指導PBS序列設計”、“雙pegRNA策略”及“逆轉錄酶的工程化改造”三種優(yōu)化策略，將引導編輯系統(tǒng)效率平均提升了10倍以上，并開發(fā)了在線的高效、自動化引導編輯實驗設計網站PlantPegDesigner（Lin et al., Nature Biotechnology, 2021; Zong et al., Nature Biotechnology, 2022）。
為了進一步推進引導編輯的應用，高彩霞研究組應邀在Nature Protocols雜志發(fā)表文章，詳細介紹了如何克服引導編輯設計復雜的問題。該論文首先描述了高效pegRNA的設計方法：前期研究發(fā)現植物細胞中pegRNA的編輯效率與PBS序列的Tm值（melting temperature,Tm）有關，在水稻中PBS序列Tm值為30℃的pegRNA能夠獲得最大的編輯效率；使用雙pegRNA策略，即針對所需突變同時向細胞中遞送分別靶向DNA兩條鏈的兩個pegRNA進行共同編輯，可以進一步大幅度提升植物引導編輯的編輯效率。接下來，作者詳細描述了在線自動化pegRNA設計網站PlantPegDesigner的使用流程，該網站能夠兼顧上述兩種策略，提供完整的pegRNA選擇、設計與推薦方案，方便使用者快速設計高活性pegRNA。進一步地，該論文對如何使用能夠穩(wěn)定提高編輯效率的ePPE引導編輯器進行了詳細描述。相比于傳統(tǒng)版本的引導編輯器，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下的編輯效率顯著提升，且不增加副產物及脫靶效應。接下來，本論文對載體組合的使用、基于原生質體的編輯效率檢測、引導編輯系統(tǒng)的植物細胞熒光報告系統(tǒng)的使用和引導編輯實驗結果的二代測序數據分析等流程進行了詳細描述。使用該文章描述的實驗方法，可以在2～3周內完成引導編輯的原生質體實驗，最快在3個月內獲得經過引導編輯的再生水稻植株。此外，該方法可以便捷地推廣到其他物種中，并隨著新型引導編輯工具的不斷優(yōu)化而得到更廣泛的應用。
三位審稿人均對該文章給予了高度評價：“作者全面、系統(tǒng)地介紹了如何在作物中實現高效的基因組編輯，以流暢、易讀的方式總結了引導編輯的實驗方法”；“該論文邏輯清晰，對想在水稻或其他植物物種中進行引導編輯的研究人員非常有用”；“這是一篇想對水稻、小麥或玉米進行引導編輯的科研人員的非常好的實驗指南”。
該文章于2020年11月25日在線發(fā)表于Nature Protocols雜志（DOI:10.1038/s41596-022-00773-9）。高彩霞研究組博士后靳帥、林秋鵬為該論文的第一作者，高彩霞研究員為通訊作者。北京齊禾生科生物科技有限公司的高強博士參與了此項工作。該研究得到農業(yè)部、中國科學院戰(zhàn)略性先導專項A、中國科學技術協(xié)會青年人才托舉工程、博士后創(chuàng)新人才支持計劃等項目的經費資助。
圖：高效植物引導編輯實驗流程。(a) 高效、自動化的pegRNA 設計方法 (b) 引導編輯實驗設計與植物突變體獲得。
標簽： 引導編輯系統(tǒng)
